Reactie op Jansen et al. (2024): 16S rRNA-gen sequencing versus FISH bij darmmicrobioom analyse

Reactie op Jansen et al. (2024): 16S rRNA-gen sequencing versus FISH bij darmmicrobioom analyse

Inleiding: Waarom kritisch kijken naar NL-Labs claims?

Onlangs publiceerden Jansen et al. (2024), medewerkers van NL-Lab, het artikel Advancements in analytical methods for studying the human gut microbiome. Hierin presenteren ze hun eigen gepatenteerde FISH-technologie als superieur aan de gangbare 16S-next generation sequencing (16S-NGS) voor darmmicrobioom analyse. Gezien hun financiële en professionele belangen is een gezonde dosis scepsis hier echter niet overbodig. De auteurs van het betreffende artikel zijn werkzaam bij het commerciële bedrijf NL-Lab/Biotrack en benadrukken FISH als voorkeursmethode, wat samenvalt met de techniek waarin hun bedrijf is gespecialiseerd. Zij hebben in de publicatie een conflict of interest vermeld: “Authors G.J. Jansen, G.P. Schouten, and M. Wiersma are employed by the commercial company Biotrack, NL-Lab, and utilize the FISH technique. They hold patents…”?

In tegenstelling tot Jansen et al. en NL-Lab baseren wij onze analyse niet op eigen onderzoek, maar op onafhankelijke, internationale studies waarin elke vorm van belangenverstrengeling aantoonbaar is uitgesloten. Wij onderwerpen hun beweringen dan ook aan een grondige wetenschappelijke feitencheck, en brengen mogelijke belangenverstrengeling, het risico op misleiding en opportunistische elementen in hun marketingstrategie kritisch in kaart.

NL-Lab had oorspronkelijk hun FISH-technologie ingezet om SARS-CoV-2 tijdens de COVID-19-pandemie op te sporen. Nu deze pandemie eerder is afgezwakt dan wellicht verwacht, heeft NL-Lab de toepassing van hun dure apparatuur verlegd naar darmmicrobioom analyse. Deze opvallende draai roept vragen op over de wetenschappelijke motivatie achter hun huidige promotie van FISH als dé oplossing voor microbiota-onderzoek. Immers, als je enige gereedschap een hamer is, begint ieder probleem op een spijker te lijken.

NL-Lab verspreidt hun claims actief via eigen marketingkanalen en die van hun partners. Hierbij rekenen zij erop dat behandelaren en zorgverleners niet altijd de tijd hebben of de moeite nemen om zich diepgaand te verdiepen in de wetenschappelijke onderbouwing ervan. Juist daarom presenteren wij hier een kritische en onafhankelijke analyse, om zorgverleners te helpen voorkomen dat ze door dergelijke marketingclaims misleid worden.

16S rRNA-gen sequencing: de gouden standaard voor microbioomanalyse

16S rRNA-gen sequencing wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor bacteriële identificatie en microbiële gemeenschapsanalyse. Deze methode richt zich op het 16S ribosomaal RNA-gen, dat aanwezig is in vrijwel alle bacteriën en zowel sterk geconserveerde als hypervariabele regio’s bevat. Dankzij deze conservatie kunnen universele primers vrijwel alle bacteriën in een monster amplificeren, terwijl de hypervariabele regio's zorgen voor onderscheid tussen bacteriesoorten.

Bij 16S-NGS wordt eerst DNA uit het fecesmonster geïsoleerd. Vervolgens worden één of meerdere hypervariabele regio’s van het 16S-gen vermeerderd en met moderne sequencingtechnieken (NGS-platforms) parallel geanalyseerd. Deze NGS-platforms genereren miljoenen DNA-sequenties in één run, waardoor duizenden bacteriële soorten tegelijk geïdentificeerd kunnen worden. In tegenstelling tot methoden als kweek of gerichte PCR vereist 16S-NGS geen voorkennis van de aanwezige microben; nieuwe en onverwachte organismen worden automatisch ontdekt via hun unieke DNA-sequenties.

Studies hebben aangetoond dat 16S-NGS een zeer breed beeld geeft van het darmmicrobioom. Klassieke onderzoeken ontdekten via 16S-sequencing honderden verschillende bacteriële phylotypes in de menselijke darm, waarvan meer dan 60% tot dan toe onbekend was en ongeveer 80% niet gekweekt kon worden. Dit toont duidelijk aan hoeveel meer informatie deze sequencingtechnologie oplevert in vergelijking met traditionele methoden. De verkregen sequenties worden vergeleken met uitgebreide databases, wat een gedetailleerd en betrouwbaar profiel oplevert van microbiële samenstelling en diversiteit.

Hoewel 16S-NGS enkele praktische uitdagingen kent, zoals DNA-extractie uit feces (dat inhibitoren bevat die PCR kunnen verstoren) en complexe data-analyse, zijn deze met de juiste expertise goed te overwinnen. Dankzij standaardprotocollen en commerciële beschikbaarheid is 16S-analyse inmiddels toegankelijk voor vele laboratoria wereldwijd. De enorme hoeveelheid wetenschappelijke literatuur die steunt op 16S rRNA-gen sequencing benadrukt de betrouwbaarheid en waarde van deze methode.

FISH-technologie: gericht, maar zeer beperkt (zelfs met AI-hulp)

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) visualiseert bacteriën via fluorescente RNA-probes, wat mooi is voor het spotten van bacteriën ter plaatse (bijvoorbeeld in weefsels). Echter, bij darmmicrobioomanalyse loopt FISH tegen forse beperkingen aan:

Beperkte breedte: Je ziet alleen bacteriën waarvoor je vooraf probes hebt gemaakt. Onbekend maakt dus letterlijk onbemind [Paul et al., scirp.org]. Bovendien worden vanwege hoge kosten waarschijnlijk ook niet altijd probes voor alle bekende bacteriën gemaakt, waardoor zelfs bekende soorten mogelijk over het hoofd gezien worden.

Weinig gevoeligheid voor zeldzame soorten: Microscopisch tellen betekent onvermijdelijk zeldzame soorten missen die zich aan het "oog" onttrekken 

Lastige kwantificatie: Gelijktijdig tientallen soorten onderscheiden is lastig wegens overlappende fluorescente labels en variabele RNA-intensiteiten per cel.

Beperkte resolutie tot geslachtsniveau: FISH identificeert bacteriën meestal alleen op geslachtsniveau (bijvoorbeeld Lactobacillus of Bifidobacterium) en biedt geen inzicht in de specifieke soorten binnen dit geslacht. Dit is klinisch van groot belang omdat verschillende soorten binnen hetzelfde geslacht sterk uiteenlopende effecten op de gezondheid kunnen hebben, zoals uit diverse onderzoeken is gebleken. In tegenstelling tot FISH biedt 16S-NGS wél inzicht in specifieke soorten en hun klinisch relevante verschillen.

Arbeidsintensief en specialistisch: Zelfs geautomatiseerde systemen met AI blijven beperkt tot vooraf vastgelegde panels en zijn afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur.

Bepaling van diversiteit: een belangrijke tekortkoming van FISH

Een hoge microbiële diversiteit wordt door alle experts als fundamenteel beschouwd voor een gezonde darmflora. Dit legt meteen een belangrijke tekortkoming bloot van de FISH-methode wanneer het gaat om het meten van diversiteit in het darmmicrobioom.

FISH is namelijk niet in staat om een betrouwbare diversiteitsmeting uit te voeren. Dit komt doordat FISH werkt met vooraf ontworpen probes, gericht op specifieke en reeds bekende bacteriegroepen. Hierdoor detecteert deze methode uitsluitend de bacteriën waarvoor al een probe is ontwikkeld. Elk organisme buiten dit geselecteerde panel blijft volledig onopgemerkt. Hierdoor mist FISH per definitie een aanzienlijk deel van de bacteriële diversiteit, vooral onbekende, minder frequent voorkomende, of nog niet gekarakteriseerde bacteriën.

Wat NL-Lab waarschijnlijk doet, is enkele bekende bacteriegroepen tellen met specifieke probes en de overige bacteriën simpelweg optellen in een algemene categorie "overige bacteriën" – zonder enige verdere identificatie. Dit creëert een misleidende indruk van volledigheid, maar geeft geen werkelijk inzicht in de daadwerkelijke microbiële diversiteit. Een hoge diversiteit omvat juist ook de aanwezigheid van onbekende of laag-abundante soorten, iets wat FISH per definitie niet kan vastleggen.

In tegenstelling tot FISH kan 16S NGS de microbiële diversiteit wél nauwkeurig meten omdat deze methode onafhankelijk van voorafgaande kennis álle aanwezige bacteriën tegelijk detecteert via DNA-sequencing. Zo wordt juist de uitgebreide microbiële diversiteit inzichtelijk, inclusief nieuwe en zeldzame soorten die essentieel zijn voor een gezond microbioom.

Samenvattend is FISH inherent ongeschikt voor diversiteitsmetingen in het darmmicrobioom, terwijl juist diversiteit essentieel is voor het begrijpen van darmgezondheid. Dit vormt dan ook een fundamenteel kritiekpunt op de claims die NL-Lab doet.

Hoewel NL-Lab pronkt met geavanceerde robotica en AI, blijft het probleem fundamenteel hetzelfde: je meet enkel wat je al kent en verwacht.

 

Misleidende claims van NL-Lab onder de loep

Claim 1: “FISH meet 96% van het microbioom, NGS slechts 90%”

Deze uitspraak is zeer misleidend en ontbeert elke wetenschappelijke onderbouwing. NL-Lab stelt letterlijk dat hun FISH methode 96%-100% van het darmmicrobioom correct identificeert, tegenover slechts 90% bij NGS. Er bestaat echter geen onafhankelijke studie die dit percentage ondersteunt. De algemene consensus in de microbiologie stelt juist dat 16S-NGS een breed en nauwkeurig overzicht biedt van bacteriële gemeenschappen, waarbij moderne analyses vaak meer dan 80–95% van de reads op tenminste speciesniveau (soort) identificeren. De claim van NL-Lab impliceert een onrealistisch hoge identificatiegraad met hun beperkte probe-set, zonder hiervoor enige wetenschappelijke onderbouwing te geven.

Claim 2: “Overige bacteriën”-categorie duidt op onvolledigheid

NL-Lab gebruikt op de website de categorie “overige bacteriën” om volledigheid te suggereren, maar feitelijk benadrukt dit juist de beperking van hun methode. Deze restcategorie toont aan dat er bacteriën aanwezig zijn die niet door hun specifieke probes gedetecteerd kunnen worden. Deze groep blijft ongeïdentificeerd en onbeschreven. Bij 16S-NGS wordt elk bacterieel DNA-fragment in het monster gesequencet, waardoor ook onbekende bacteriën achteraf geïdentificeerd kunnen worden. De claim van volledige dekking via FISH is hierdoor misleidend en verhult belangrijke beperkingen.

Claim 3: Uniek in het meten van microbiële activiteit en intracellulaire pathogenen

NL-Lab beweert uniek te zijn in het meten van microbiële activiteit en intracellulaire pathogenen. Hoewel FISH inderdaad microbiële activiteit kan meten via ribosomaal RNA, zijn vergelijkbare of betere metingen mogelijk via andere technieken zoals RNA-sequencing (metatranscriptomics) of metabolische labeling. Ook intracellulaire pathogenen kunnen via diverse andere gevestigde technieken zoals PCR worden opgespoord. NL-Lab’s claims van uniciteit zijn daarom sterk overdreven en misleidend, aangezien hun methode niet aantoonbaar superieur of uniek is ten opzichte van bestaande technieken.

Claim 4: Geen vermelding van beperkingen of onafhankelijke validatie

NL-Lab benadrukt de voordelen van hun FISH-methode, maar vermeldt nergens de inherente beperkingen ervan, zoals afhankelijkheid van specifieke probes en gebrek aan detectie van onbekende bacteriën. Ook ontbreekt elke vorm van onafhankelijke validatie. Normaal gesproken worden nieuwe methoden vergeleken met bestaande gouden standaarden in peer-reviewed studies, maar NL-Lab biedt dergelijke validatie niet aan. Hierdoor ontbreekt het wetenschappelijke fundament om hun claims serieus te nemen en ontstaat het risico dat klinische beslissingen worden gebaseerd op onvoldoende gevalideerde methoden.

Conclusie: Innovatie vereist validatie, niet alleen marketing

16S-NGS blijft voorlopig de meest betrouwbare methode voor breed microbiota-onderzoek. FISH heeft zijn niche, maar voldoet niet als primaire techniek voor darmmicrobioomanalyse. De superioriteitsclaims van NL-Lab blijven onbewezen en berusten vooral op commerciële belangen en marketingretoriek. Innovatie moet verwelkomd worden, maar alleen als die grondig en onafhankelijk gevalideerd is. Tot die tijd raden we aan: kritisch blijven, hypes negeren en vertrouwen op goed onderbouwde wetenschap.

Bronnen: 

1.Yuejun Shi, Guiqing Peng, Ashenafi Assefa Gebremariam, Muhammad Muazzam Iqbal,Hakimeh Baghaei Daemi, Muhammad Ali Khan, Rizwan Ullah & Donghan Wang 16S-NGS verbetert microbiome onderzoek aanzienlijk animaldiseases.biomedcentral.com

 

2.Shirin Moossavi , Phillip A Engen , Reza Ghanbari , Stefan J Green, Ankur Naqib, Faraz Bishehsari, Shahin Merat ^1,7, Hossein Poustchi, Ali Keshavarzian, Reza Malekzadeh – 16S sequencing is voorkeursmethode voor identificatie van onbekende bacteriën pmc.ncbi.nlm.nih.gov

3.Maja Kosecka-Strojek , Artur J Sabat , Viktoria Akkerboom , Karsten Becker , Evert van Zanten , Guido Wisselink , Jacek Miedzobrodzki , Anna M D (Mirjam) Kooistra-Smid, Alexander W Friedrich 16S sequencing is voorkeursmethode voor identificatie van onbekende bacteriën  Pmc.ncbi.nlm.nih.gov

 

4.Zhang, J. , Zhang, G. and Jin, S. (2022)– Review of the Clinical Applications of Metagenomic Next-Generation Sequencing in Bloodstream Infection https://www.scirp.org/journal/paperinformation?paperid=115869#:~:text=etc,multiple%20pathogens%20and%20their%20antibiotic

 

5.Hoffmann D et al. Perspectives: Direct-to-consumer microbiome tests. Science. 2024; 379(6635):269-271 –Umaryland.edu

6.NL-Lab Gijsbert J. Jansen, Gerard P. Schouten, and Marit Wiersma (2024)

7.NL-Lab Gijsbert J. Jansen1, Marit Wiersma, Willem J. B. van Wamel, Inge D. Wijnberg 08-2021

8.NL-Lab Gijsbert J. Janse n, Marit Wiersma 09-2021

9.NL-Lab Gerrit G. Tamminga, Gijsbert J. Jansen, Marit Wiersma 11- 2022

10.Creative biolabs: https://live-biotherapeutic.creative-biolabs.com/why-16s-rrna-sequencing-is-the-gold-standard-for-bacterial-identification.htm